CRM综述︱香港中文大学（深圳）刘国珍/厦门大学杨朝勇等评述：微流控单细胞测序在癌症精准医学中的应用

撰文︱韩昕

审阅︱刘国珍，杨朝勇

责编︱王思珍，方以一，郭渺

患者之间和肿瘤之间存在的异质性直接影响着肿瘤的增值、转移和治疗。因此，精准医疗 （precision medicine）的理念已经引起越来越多的关注，即根据特定患者的细胞和基因组的特异性制定独特的治疗计划。 其核心内容需要准确表征癌症的特定分子或细胞特征及其微环境，为个体患者提供最优的治疗选择。 标准肿瘤学细胞测序涉及对由数千到数百万个细胞组成的大样本进行批量分析。 然而，该技术受到关于可能驱动关键肿瘤过程的单个细胞的结构和功能特性的重要信息的丢失的限制。 为了解决这一困境，人们开发了单细胞测序来理解单个细胞内复杂的遗传变异性。从单细胞测序获得的信息可能在预测治疗反应、跟踪疾病进展、预后、预测治疗效果和出现的耐药性等方面具有重要作用。 微流控技术（microfluidic technologies）与单细胞测序平台 （single-cell sequencing）的联用，发挥各自的技术优势，不仅可以提高测序通量，而且有利于构建高度集成和自动化单细胞测序平台，从而服务临床及癌症精准医疗。

图1. 基于微流控的单细胞测序在癌症精准医疗中的应用和挑战示意图

2023年9月，香港中文大学（深圳）刘国珍教授课题组联合厦门大学杨朝勇教授课题组在Cell Reports Methods（CRM）上发表了题为“Microfluidic design in single-cell sequencing and application to cancer precision medicine”的综述文章。韩昕为该论文第一作者，是香港中文大学（深圳）医学院刘国珍教授课题组的一名博士生。刘国珍教授和杨朝勇教授为共同通讯作者。本研究获得了国家自然科学基金面上项目及国家自然科学基金外国资深学者研究基金支持。 这篇综述中，作者们总结了单细胞组学分析技术和应用于测序技术的微流控技术，强调了结合微流控单细胞测序技术应用于肿瘤精准医疗的可能性、挑战和潜力。

一、基于微流控技术的单细胞分离

 单细胞测序（SCS）一般包括这几个步骤：（1）样本采集；(2) 细胞分离；(3) 细胞裂解； (4) 扩增（文库制备）；(5) 测序（例如Illumina、Ion Torrent、Pacific Biosciences和Oxford Nanopore技术）；(6) 细胞单组学或多组学分析。基于微流控的细胞分离提供了小样本量和高通量的优势，被广泛应用于单细胞测序的研究和商业化产品开发。根据微流控技术原理的不同，用于单细胞测序的微流控芯片可分为两大类：一类是基于微结构捕获的芯片，另一类是基于外力的芯片。该文章概述了常用的六种微流控结构，表1总结了这些结构的优缺点。

基于液滴的微流控 （droplet-based microfluidics）因其操作简单、高通量和低成本而成为最常用的单细胞分离方法之一，但其存在产生空液滴和含有多个细胞的液滴，以及液滴存在泄露等问题。基于阀的微流控 (valve-based microfluidics)可以集成数百到数千微阀，允许精确且自动的操作细胞和试剂，但较高的设备制造成本和复杂的操作为其广泛商业应用带来挑战。基于水动力陷阱的微流控（hydrodynamic trap-based microfluidics）允许单个细胞被流体流动引起的涡流有效的捕获在物理屏障中，可以实现大通量的单细胞分离，但其捕获效率和陷阱堵塞是需要考虑的问题。基于重力驱动的微孔阵列的微流控 （microwell-based microfluidics），因其简单性和可扩展性，微孔阵列在单细胞测序领域广泛应用。但其存在着易发生交叉污染，且难以回收样本的局限性。基于电介质电润湿的数字微流控（electrowetting-on-dielectric microfluidics）在处理皮升和微升体积的液体时具有出色的灵活性和简单性，但其制造工艺复杂且成本较高是其广泛应用中不可忽视的问题。基于介电电泳的微流控（dielectrophoresis-based microfluidics）具有非侵入性和高特异捕获效率等优点而广泛应用于细胞分离中，但其存在焦耳热、气泡产生和珍珠链等挑战。

表1. 不同微流体分离单细胞方法的示意图和比较

二、与微流控结合使用的单细胞测序模式

 对单细胞基因组（genome）、转录组（transcriptome）、表观基因组（epigenome）、蛋白质组（proteome）等基本组学成分进行测序，有助于揭示癌症以实现精准治疗的快速发展。微流控与单细胞组学分析的结合具有多种优势，不仅提高了细胞分析的通量和灵敏度，而且还降低了扩增过程中污染和偏差的可能性。表 2 总结了 SCS 在癌症学中的部分方法和应用。表3列举了一些基于微流控的单细胞测序在癌症学中的应用。

表2. SCS方法的部分总结及其在肿瘤学中的应用

表3. 基于微流体的SCS在癌症精准医学中的应用

三、在癌症精准医疗中实施基于微流控测序方法的未来前景

 单细胞测序微流控的结合可以在一定程度上提高测序通量并降低成本。最流行的基于液滴的 10X Genomics 的实验成本约为每个细胞 0.87 美元液滴大小和数量非常灵活可控，但液滴共封装效率不理想且液滴泄露可能会干扰测序结果。相比之下，基于微孔的技术生产力更高。基于 Smart-seq3 的微孔测序平台的价格约为每个细胞 1.14 美元，虽处于可承受的水平。但是，除了基于液滴和微孔的单细胞测序 灵敏度较低之外，更关键的是，在某些情况下，由于大量细胞的浅层测序，数以万计或更多细胞的 SCS 测序的总体成本仍然过高。基于液滴和微孔的微流体与样品多重技术 （sample multiplexing technologies）的结合为提高通量和降低成本提供了进一步的可能性。与此同时，随着数字微流控作为一种创新微流控技术的出现，它可以将整个单细胞测序流程带入微流控平台，提供着自动化的可行性。但这种平台的通量存在局限性。总的来说，单细胞测序应用于精准医疗或其他医疗领域时，成本、准确及快速地分析大量细胞样本是最重要的几个考虑因素。当前分子生物学、计算机和机械工程领域的多学科发展及协作联用合作，有利于解决这些挑战。

四、总结和展望

 肿瘤是动态发展的，其肿瘤微环境是一个具有多种生化和生物力学特性的空间，也是一个复杂的动态系统，对肿瘤免疫有直接影响。对肿瘤克隆动力学的了解将为肿瘤的转移、药物治疗和耐药性带来全新的前景。越来越多的单细胞测序研究是从空间和时间的角度进行的。例如，slide-DNA-seq作为一种技术，可以对整个组织进行空间分辨 DNA 测序。这种空间SCS技术除了保留空间为癌症进展提供更多线索外，它与细胞成像的结合可以描述细胞形态并为下游数据分析增加注释可靠性。

由于细胞的单一组学分析只能提供有关细胞异质性的碎片化部分信息，因此测量细胞的空间多组学正在成为一种更具有视角和更全面的细胞洞察方式。随着单细胞多组学数据分析工具数量的不断增加，这些数据库可以为各种癌症类型的不同治疗开辟新途径。 未来，单细胞空间多组学分析将能够通过加速发现多种癌症的新致病机制和治疗方法，在肿瘤精准治疗方面取得新突破。

微流控技术的引入不仅可以实现减少样品体积来降低成本，而且有助于实现高通量。 此外，一些新兴技术提供了将单细胞测序程序集成到微流体平台上的可能和未来单细胞空间组学的机遇，有望带来集成器件自动化和更高的测序准确性。 因此，作者们期望未来能够开发性价比更高、更加自动化和简化的单细胞测序平台，更好地服务临床精准医疗。

通讯作者简介：刘国珍：香港中文大学（深圳）医学院教授，校长学者，香港中文大学（深圳）-博雅生命再生医学工程校企联合实验室主任。发表SCI论文160余篇，Frontiers in Bioengineering and Biotechnology专栏主编，Biosensors & Bioelectronics特刊编辑。主要研究方向为生物传感器、微流控生物芯片、柔性可穿戴器件、体外诊断、智能纳米颗粒及医疗器械。

杨朝勇：厦门大学化学化工学院化学生物学系教授，上海交通大学医学院分子医学研究院副院长，发表SCI论文 300 余篇，Analytical Chemistry副主编，主要研究方向为微流控、液体活检、单细胞分析、纳米生物医学工程, 功能化DNA纳米组装。

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